致命真菌-耳念珠菌知多少

导读

地球上存在着约600万种真菌组成的庞大网络，它们是鞋子上的霉斑、树林里的蘑菇、面包中的酵母，它们分解岩石、滋养植物，它们在我们的身边甚至体内大量存在，维持着生态系统的平衡。

通常来说，人体并不容易受到真菌侵袭，人体的免疫系统可以高效地防御这些入侵者，而且人体体温环境并不适合真菌的生长，但体表因为体温相对较低，人们有时可能会因为真菌感染而患上一些真菌性的皮肤病。而免疫系统受损的人则更容易被真菌乘虚而入——40年前，因为卡氏肺孢子菌（Pneumocystis carinii）引发的罕见肺炎，才让医生注意到第一批感染HIV的患者。

然而这种平衡状态正在被打破。正如Emory University研究员、科学作家Maryn McKenna所说的那样，“真菌开始跳出之前长期生活的气候区域，去适应一度对它们有害的环境，演化出一些让它们能跨物种传播的能力。通过这些改变，它们正在变为更成功的病原体，以前所未有的方式威胁着人类的健康。”然而，我们所拥有的控制真菌感染的手段，还远远不够。

「超级真菌」袭来

耳念珠菌（Candida auris）的形态与日常烘焙、发酵中使用的酵母菌极为相似，在2009年首次在一名日本患者的耳道中分离出来，随即被认定为是一种新品种的真菌，并开始在全球蔓延。截至2021年2月，已经遍布6大洲40多个国家。（图1）

图1 目前已发现耳念珠菌感染的国家

图片来源：Maryn McKenna, 冯健举译. 致命真菌:被忽视的敌人[J]. 环球科学, 2021(13):10.

耳念珠菌是一种多重耐药真菌，目前已知的每个基因型菌株，都至少对一种主要抗真菌药物具有耐药性，一些临床分离菌株甚至对三种主要抗真菌药物（唑类、多烯类、棘白霉菌类）均耐药。

2019年，美国疾病控制和预防中心（CDC）将耳念珠菌列入紧急威胁名单。（图2）

图2 美国CDC耐药微生物威胁名单

图片来源：//p1-tt.byteimg.com/origin/tos-cn-i-tjoges91tu/T9ITyD3FNvRWi9.jpg" style="width: 650px;">

文章指出，迄今为止，中国的耳念珠菌感染具有以下几个特点：

大多数病例与浅表组织（例如泌尿道）有关，而观察到血液或深层组织和器官感染的频率较低；

中国大多数医院报告了散发性耳念珠菌病例，而不是聚集性感染，只在两家医院（沈阳和香港）发生了两起耳念珠菌群体感染；

中国报道的大多数耳念珠菌临床分离株仅对氟康唑耐药，尽管一些分离株对两性霉素B和棘白菌素表现出较高的MIC，但这可能是由于最近对抗真菌药物使用的进化适应。在中国所有氟康唑耐药分离株中均能观察到抗真菌蛋白Erg11的F126L或VF125AL突变；

中国大多数耳念珠菌病例发生在55岁及以上的ICU患者中，他们通常有基础疾病史，例如糖尿病和/或高血压；

易患耳念珠菌定植或感染似乎与长期住院和/或抗真菌药物治疗存在普遍相关性。

目前，中国对耳念珠菌的临床和基础研究都很有限，许多悬而未决的问题仍有待解决。例如耳念珠菌通过传统的微生物学鉴定技术无法进行分离鉴定，这就使得对于耳念珠菌所引起的感染无法及时进行确诊。

为此，中华医学会检验分会临床微生物学学组在2020年8月，在《临床检验杂志》上刊发了《成人耳念珠菌感染诊治防控专家共识》，对耳念珠菌的分离鉴定作出了明确指导，我们对该《共识》关于分离鉴定的核心部分进行摘录。

识别威胁——耳念珠菌的微生物学鉴定

1 疑似耳念珠菌的提示

遗传分析显示，该菌与葡萄牙念珠菌、希木龙念珠菌等关系较为密切。

推荐1

以下情形须考虑耳念珠菌的可能性：

（1）念珠菌在25 ℃ 不形成假菌丝，42 ～ 45 ℃ 能够生长；

（2）Vitek YST：鉴定为希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌、C. duobuhaemulonii、无名念珠菌；

（3）API 20 CAUX：鉴定为胶红酵母（Rhodotorula glutinis）（但没有特征性红色素）、清酒念珠菌（C. sake）或鉴定结果不确定（unidentified）；

（4）API Candida：鉴定为无名念珠菌；

（5）BD 凤凰念珠菌鉴定卡：鉴定为希木龙念珠菌、链状念珠菌；

（6）MicroScan：鉴定为白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、无名念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌；

（7）RapID Yeast Plus：鉴定为近平滑念珠菌；

（8）生物梅里埃质谱：鉴定为白念珠菌、希木龙念珠菌或鉴定结果不确定；

（9）念珠菌对唑类多重耐药或对两性霉素B耐药。文献报道，93％的耳念珠菌临床分离株对氟康唑耐药，33％对伏立康唑耐药，35％对两性霉素B耐药。

2 分离鉴定技术

该菌镜下形态学无特征性提示，需要菌落分纯后进行菌种鉴定。正确鉴定要求人员意识到位、经验充足、质控在控，结果有可信性、重复性、可比性。

2.1 传统方法

推荐2

Vitek 2 YST 8.01 版本可以鉴定耳念珠菌；该版本鉴定的希木龙念珠菌、C. duobuhaemulonii，需要进一步判断是否耳念珠菌。而BD 凤凰念珠菌鉴定卡、MicroScan、生物梅里埃API 20C、RapID Yeast Plus 不能鉴定该菌。

推荐3

显色培养基可做初步鉴定，但不能最终鉴定。耳念珠菌在沙保弱琼脂培养基上菌落为白色或奶油色，在CHROMagar 平板上为粉色或米黄色，培养第4 天可变为淡粉红色或紫色。念珠菌显色琼脂CHROMagar Candida或ChromaID Candida可以初步区分希木龙念珠菌与耳念珠菌。耳念珠菌在24 h 内可长出更大的菌落，并且在24～48 h 内菌落颜色从无色变为粉红色或米色。该菌42 ℃生长良好（而希木龙念珠菌不能在42 ℃ 生长），加0.01％放线菌酮不生长。因为颜色多样、无特征性，所以显色培养基无法做最终鉴定。

2.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assistedlaser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）

推荐4

布鲁克质谱仪，MALDI Biotyper CA system（版本4）或Bruker RUO 数据库（2014[5627]及以上版本数据库）可以鉴定该菌。Bitoyper RUO 数据库鉴定耳念珠菌准确率为75.4％ ～100％。样本处理推荐乙醇/甲酸提取法。

推荐5

生物梅里埃质谱仪，MS IVD 3.2 版本（IVD）该版本的数据库目前尚未获得美国食品药品监督管理局认可）或MS Saramis 4.14 及以上版本（RUO）可以鉴定该菌。生物梅里埃质谱仪Vitek MS 的IVD 3.2 版本鉴定耳念珠菌的准确率为96.7％，RUO 数据库鉴定耳念珠菌的准确率为93.4％。样本处理推荐直涂法。

2.3 分子生物学方法

推荐6

用26S rDNA D1/D2 区域或内转录间隔区（internaltranscribed spacer，ITS）序列作为菌种鉴定的目标，引物序列如下。ITS 上游引物：5′-GTCGTAACAAGGTTAACCTGCGG-3′，下游引物：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；26S rDNA D1／D2 区上游引物：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，下游引物：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。

基于上述引物进行PCR 扩增和测序，结果须可重复、可验证、可比较。和GenBank数据库中耳念珠菌南亚、东亚、南非、南美或伊朗分支中任一分支的基因序列相比，序列比较一致性超过98%，认为是同一个菌种。

推荐7

与耳念珠菌表型相近的希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌、Candida duobushaemulonii 鉴别时，可考虑采用实时PCR（real-time PCR）方法。耳念珠菌特异性引物：F：5′-CGCACATTGCGCCTTGGGGTA-3′；R：5′-GTAGTCCTACCTGATTTGAGGCGAC-3′。耳念珠菌及相关种属（耳念珠菌、希木龙念珠菌、葡萄牙念珠菌、Candida duobushaemulonii）特异性上游引物：5′-GCGATACGTAGTATGACTTGCAGACG-3′；下游引物：5′-CAGCGGGTAGTCCTACCTGA-3′。

理由：Kordalewska 等用此体系对140 株临床分离真菌菌株（含44 株耳念珠菌、7 株希木龙念珠菌、6 株葡萄牙念珠菌、6 株Candida duobushaemulonii、73 株其他酵母样真菌和4 株丝状真菌）进行鉴别，其结果与基于rDNA 的测序结果100%一致。

3 原始标本的分子生物学检测

推荐8

以耳念珠菌ITS2 基因为靶标，用实时荧光PCR（TaqMan 探针法）检测临床样本中的耳念珠菌，引物及探针序列如下。ITS2 基因特异性引物F：5′-CAGACGTGAATCATCGAATCT-3′，R：5′-TTTCGTGCAAGCTGTAATTT-3′，探针P：5′-FAM-AATCTTCGC-ZEN-GGTGGCGTTGCATTCA-IFQ-3′。bicoid 基因特异性引物F：5′-CAGCTTGCAGACTCTTAG-3′，R：5′-GAATGACTCGCTGTAGTG-3′，探针P：5′-Quas570-AACGCTTTGACTCCGTCACCCA-IRQ-3′。

理由：Leach 等利用实时荧光PCR 检测临床样本的敏感性介于89％ ～ 100％，Ahmad 等进一步用247 例确诊病人皮肤样本进行评价，证实该方法具有良好的诊断性能（敏感性93.6％，特异性97.2％）。美国疾病控制与预防中心（//p1-tt.byteimg.com/origin/tos-cn-i-tjoges91tu/T9ITyDYJ9VVoTo.jpg" style="width: 650px;">

4.3 耐药机制检测

在氟康唑耐药的耳念珠菌菌株中，ERG11 基因所编码的氨基酸置换F126L、Y132F 和K143R 的发生率远高于敏感株。另外，由于ERG11 编码的羊毛甾醇14α-去甲基化酶（ERG11p）是唑类药物作用的主要靶位，故ERG11 的表达上调也可导致需更高浓度药物与ERG11 结合从而引起耐药。FKS1 基因参与编码1，3-β-D-葡聚糖合成酶，这也是棘白菌素发挥作用的靶点。FKS1 的热点区编码S639F 突变可能导致耳念珠菌对棘白菌素药物的亲和力降低从而引起耐药。

5 同源性研究技术

推荐18

耳念珠菌聚集性或暴发性出现时，须进行同源性分析。

推荐19

根据文献，推荐以下同源性分析技术。

（1）脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）：韩国学者用PFGE 技术对耳念珠菌进行同源性分析。判断标准为：菌株之间条带大小和数量一致，则认为是同一型别；1～3 条条带变化则认为是高度相近型别；4 条及以上条带变化则认为是不同型别。

（2）多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）：通过PCR 扩增4 个管家基因内部片段（RPB1，RPB2，ITS 和D1／ D2）并测定其序列，分析菌株变异。利用该方法，韩国学者确定了ST2 型的流行株，印度学者成功区分来自印度、南非、巴西、日本和韩国的104 株耳念珠菌并构建系统发育树。

（3）M13 DNA PCR：Chowdhary 等用M13 DNA PCR 技术对12 株耳念珠菌进行基因分型，结果成功区分10 株来自印度和来自日本和韩国各1 株的耳念珠菌的不同基因型。

（4）全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）：在病原体溯源的所有分子分型技术中，WGS 因分析范围广而具有最高的分辨力。SNP 是基因组中最为广泛的变异，代表不同个体之间的遗传差异。基于全基因组的SNP 分析（whole genome SNP，wgSNP）提供了更多的SNP 位点，通过比较SNP 信息可以对菌型进行更细致的划分。

写在后面

真菌的威胁一直以来常常没有得到应有的重视，而对于新出现的真菌威胁，我们知道得也还远远不够。

耳念珠菌在中国的原始来源是什么？是否起源于其他国家，如果是，它是如何传入中国的？应采取哪些措施来预防聚集性感染和院内或院内传播？当前抗真菌药物在临床环境中的应用是否与耳念珠菌的出现有关？C.auris的毒力和抗真菌药物耐药性是否迅速发展？这些问题我们至今都还没有答案。

在新型冠状病毒肆虐的当下，关注真菌感染，尤其是院内真菌感染尤为必要。当重症患者处于依赖于呼吸机等医疗机械，而且免疫系统受到抑制的情况下时，将显得异常脆弱。目前的研究表明，耳念珠菌可以在金属、塑料、织物、纸张等多种表面存活，抵抗多种常见的清洁剂与消毒剂。在新冠疫情的威胁下，口罩、防护服、面屏等一次性防护用具面临短缺，医护人员常常不得不重复使用这些用具，这也对耳念珠菌的传播创造了更有利的条件。

此外，黄广华教授团队在研究中还指出，希木龙念珠菌是一种与耳念珠菌密切相关的物种，并且通常也对多种抗真菌药物具有抗药性。与耳念珠菌感染相比，在中国临床环境中观察到希木龙念珠菌感染的频率要高得多，希木龙念珠菌也许更有可能成为中国的“超级真菌”？

为了解决这些紧迫的问题，需要更多的努力来研究这些新兴病原体，而这些努力将极大地依赖于临床、检验以及基础研究人员之间的通力合作。

参考文献

[1]Maryn McKenna, 冯健举译. 致命真菌:被忽视的敌人[J]. 环球科学, 2021(13):10.

[2]Du H, Bing J, Nobile C J, et al. Candida auris infections in China[J]. Virulence, 2022, 13(1): 589-591.

[3]Chen Y, Zhao J, Han L, et al. Emergency of fungemia cases caused by fluconazole-resistant Candida auris in Beijing, China[J]. Journal of Infection, 2018, 77(6): 561-571.

[4]Fan S, Zhan P, Bing J, et al. A biological and genomic comparison of a drug-resistant and a drug-susceptible strain of Candida auris isolated from Beijing, China[J]. Virulence, 2021, 12(1): 1388-1399.

[5]Williams R B, Lorenz M C. Multiple alternative carbon pathways combine to promote Candida albicans stress resistance, immune interactions, and virulence[J]. MBio, 2020, 11(1): e03070-19.

[6]CDC. 2019 AR Threats Report[EB/OL]. 2021[2022-6-17]. https://www.cdc.gov/drugresistance/biggest-threats.html.

[7]中华医学会检验分会临床微生物学学组. 成人耳念珠菌感染诊治防控专家共识[J]. 临床检验杂志, 2020, 38(8):7.

编辑：薄奕